ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀助力外用益生菌在特應(yīng)性皮炎作用機(jī)制探索

「摘要」

副干酪乳桿菌是一種益生菌，對(duì)多種過敏性疾病具有積極作用，并可通過調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮作用，其中樹突狀細(xì)胞是其關(guān)鍵靶標(biāo)之一。

2025年7月，麻布大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Mao Kaneki等研究團(tuán)隊(duì)在Preprints.org預(yù)印本平臺(tái)發(fā)表了一篇題為“Topical Administration of a Mixed Microbial Culture of Lactobacillus paracasei, Pichia membranifaciens and Saccharomyces cerevisiae Significantly Inhibits the Development of Atopic Dermatitis in a Mouse Model Through IL-10 over Expression by Dendriti"的文獻(xiàn)。

該研究采用混合微生物培養(yǎng)物L(fēng)S（含副干酪乳桿菌、膜狀畢赤酵母和釀酒酵母），通過特應(yīng)性皮炎小鼠模型，評(píng)價(jià)LS經(jīng)皮膚給藥的影響效果。方法上，利用小鼠樹突狀細(xì)胞系檢測(cè)IL-10和TNFα水平以評(píng)估免疫調(diào)節(jié)作用；在刺激的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，通過IL-8和胸腺細(xì)胞因子的產(chǎn)生評(píng)價(jià)抗炎效應(yīng)。在AD小鼠模型中，局部使用10% LS軟膏，每周記錄臨床癥狀、背部皮膚厚度及經(jīng)表皮水分流失，并在尸檢后分析耳淋巴結(jié)的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示，LS處理增強(qiáng)了DC2.4細(xì)胞分泌IL-10和TNFα的能力，同時(shí)降低了刺激的HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生IL-8和TARC。在治療組中，癥狀、皮膚厚度或TEWL未見明顯改變，但局部淋巴結(jié)中IgE陽性B細(xì)胞數(shù)量和IL-4水平有所下降。預(yù)防性涂抹LS減輕了AD癥狀。結(jié)果表明，LS通過免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用能阻止AD的發(fā)展。 

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料

LS培養(yǎng)物、小鼠樹突狀細(xì)胞系、培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素、DAPI染色劑、多種單克隆抗體、心浸液瓊脂、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、小鼠T-激活劑CD3/CD28磁珠。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠

儀器

ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀、CellDrop細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)、BD FACSAria III細(xì)胞分選儀、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定相關(guān)檢測(cè)設(shè)備。

ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀

「實(shí)驗(yàn)過程」

本研究實(shí)驗(yàn)分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行專業(yè)統(tǒng)計(jì)分析，具體過程如下：

體外實(shí)驗(yàn)：驗(yàn)證LS的免疫調(diào)節(jié)與抗炎作用

1. 樹突狀細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：將70%融合度的DC2.4細(xì)胞以1×10?個(gè)/100μL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，分別暴露于0、0.125、0.25、0.5、1mg/mL濃度的LS中，通過ELISA試劑盒定量檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-10和TNFα的濃度。

2. 角質(zhì)形成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：將70%融合度的HaCaT細(xì)胞以1×10?個(gè)/100μL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)重組人TNFα和IFNγ刺激1h后，加入含0、0.125、0.25、0.5、1mg/mL LS的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h，通過ELISA試劑盒定量檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-8和TARC的濃度。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：探究LS經(jīng)皮給藥對(duì)AD小鼠模型的治療與預(yù)防作用

1. AD小鼠模型構(gòu)建：對(duì)NC/Nga小鼠經(jīng)皮致敏Biostir AD，構(gòu)建特應(yīng)性皮炎小鼠模型。

2. 治療性給藥實(shí)驗(yàn)：在AD模型建立后的第19天（小鼠平均AD評(píng)分為2.07）開始給藥，實(shí)驗(yàn)組每日經(jīng)皮涂抹0.1mL/只的10% LS溶液，對(duì)照組每日經(jīng)皮涂抹等體積去離子水，實(shí)驗(yàn)期間每周監(jiān)測(cè)小鼠的AD評(píng)分、背部皮膚厚度、TEWL；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集小鼠耳淋巴結(jié)樣本，制備單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，通過細(xì)胞分選儀分析免疫細(xì)胞亞群，通過磁珠刺激T細(xì)胞后采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子水平，同時(shí)對(duì)小鼠皮膚樣本進(jìn)行盲法半定量組織病理學(xué)評(píng)估。

3. 預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)：設(shè)置AD對(duì)照組和LS預(yù)防性處理組，對(duì)LS組小鼠提前進(jìn)行10% LS溶液經(jīng)皮給藥，后續(xù)監(jiān)測(cè)指標(biāo)、樣本檢測(cè)與分析方法與治療性給藥實(shí)驗(yàn)一致。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

體外實(shí)驗(yàn)采用方差分析結(jié)合鄧尼特多重比較檢驗(yàn)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用雙因素方差分析結(jié)合?ídák多重比較檢驗(yàn)或?qū)W生t檢驗(yàn)，以5%為概率水平判定統(tǒng)計(jì)明顯性，所有數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 10分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

「實(shí)驗(yàn)結(jié)論」

副干酪乳桿菌、膜畢赤酵母和釀酒酵母的混合微生物培養(yǎng)物（LS）具備免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。在體外培養(yǎng)中，LS能促進(jìn)小鼠樹突狀細(xì)胞系DC2.4分泌IL-10和TNFα，并劑量依賴性地抑制經(jīng)TNFα/IFNγ刺激的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT產(chǎn)生IL-8和TARC。在AD小鼠模型中，治療性給藥未改善小鼠的臨床癥狀、皮膚厚度和經(jīng)表皮失水量，但改善了皮膚角化層增生、表皮痂皮等組織病理學(xué)特征，同時(shí)降低了局部淋巴結(jié)中IgE陽性B細(xì)胞數(shù)量和IL-4水平；而預(yù)防性給藥效果更明顯，降低了AD臨床評(píng)分，改善了皮膚組織病理學(xué)特征，并減少了局部淋巴結(jié)中的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和IL-13水平。整體而言，LS通過免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，能夠有效預(yù)防特應(yīng)性皮炎的發(fā)生發(fā)展。

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