基于經(jīng)皮水分流失測量儀評估雪腐鐮刀菌烯醇對AD小鼠皮膚屏障功能的影響

2024年4月，Tomoki Fukuyama團(tuán)隊(duì)在《Archives of Toxicology》（IF=6.9）期刊上發(fā)表了題為“Subacute oral exposure to lowest observed adverse effect level of nivalenol exacerbates atopic dermatitis in mice via direct activation of mitogenactivated protein kinase signal in antigenpresenting cells"的研究論文。該研究探討了霉菌毒素雪腐鐮刀菌烯醇（Nivalenol,NIV）的免疫毒性作用，重點(diǎn)關(guān)注其對抗原呈遞細(xì)胞的影響及其在特應(yīng)性皮炎（AD）小鼠模型中的作用。

摘要

本研究使用抗原呈遞細(xì)胞和特應(yīng)性皮炎（AD）小鼠模型，調(diào)查了霉菌毒素雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）的免疫毒性作用。體外實(shí)驗(yàn)使用小鼠巨噬細(xì)胞系（RAW 264.7）和小鼠樹突狀細(xì)胞系（DC 2.4）。細(xì)胞暴露于NIV（0.19-5μmol）24小時后，定量檢測了促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6和TNFα）的產(chǎn)生。為研究炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生通路，使用MAPK抑制劑和磷酸化分析，探究了絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（如ERK1/2、p-38和JNK）在NIV暴露中的可能參與。此外，在半抗原誘導(dǎo)的AD NC/Nga小鼠模型中，評估了低濃度（1或5 ppm）NIV口服暴露的促炎作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，暴露于NIV會促進(jìn)TNFα的產(chǎn)生。此外，使用MAPK抑制劑預(yù)處理后，TNFα的產(chǎn)生受到抑制，這表明NIV直接誘導(dǎo)了MAPK的磷酸化。與對照組相比，口服NIV暴露加劇了AD癥狀，包括耳廓淋巴結(jié)中輔助T細(xì)胞和產(chǎn)生IgE的B細(xì)胞數(shù)量增加，以及促炎細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）分泌增多。研究結(jié)果表明，暴露于NIV直接增強(qiáng)了ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，導(dǎo)致抗原呈遞細(xì)胞中TNFα產(chǎn)生增加，這與特應(yīng)性皮炎的發(fā)展密切相關(guān)。

材料與儀器

主要材料：

實(shí)驗(yàn)動物：雌性NC/Nga小鼠（7周齡）。

實(shí)驗(yàn)材料：

雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、小鼠樹突狀細(xì)胞系（DC2.4）、小鼠巨噬細(xì)胞系（RAW264.7）、TDI、抑制劑、抗體、細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、T細(xì)胞活化磁珠等。

主要儀器：

酶標(biāo)儀、實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、Western blot成像系統(tǒng)、ASCH VAPO SCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、勻漿儀

實(shí)驗(yàn)過程

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：

將DC2.4和RAW264.7細(xì)胞與不同濃度的NIV（0.19-5μmol/L）共培養(yǎng)24小時。

收集上清液，通過ELISA檢測促炎細(xì)胞因子（IL-1β,IL-6,TNFα）的蛋白水平。

提取細(xì)胞總RNA，通過qPCR檢測相應(yīng)細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平。

為探究MAPK通路，細(xì)胞暴露于NIV 2小時后，通過Western blot檢測ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化水平。

使用特異性MAPK抑制劑（ERK1/2,p38,JNK抑制劑）預(yù)處理細(xì)胞1小時，再加入NIV，檢測TNFα的產(chǎn)生情況。

體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)：

使用TDI在NC/Nga小鼠上建立AD模型。小鼠背部皮膚和耳廓每周接受TDI涂抹以誘導(dǎo)AD。

同時，通過飲用水給予小鼠不同劑量的NIV（1 ppm或5 ppm），持續(xù)4周。

實(shí)驗(yàn)期間，每周監(jiān)測AD評分、耳部和背部皮膚厚度，并用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀測量經(jīng)皮水分散失數(shù)據(jù)（TEWL）。4周后，收集小鼠的背部皮膚、耳廓淋巴結(jié)和血清樣本。

ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀

口服NIV使TEWL值上升

制備耳廓淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞術(shù)分析樹突狀細(xì)胞（CD11c+CD40+）、輔助T細(xì)胞（CD3+CD4+）和B細(xì)胞（CD19+IgE+）的數(shù)量變化。

用CD3/CD28抗體磁珠刺激淋巴結(jié)細(xì)胞，通過ELISA檢測上清液中Th2型細(xì)胞因子（IL-4,IL-5,IL-13）的釋放。

通過ELISA檢測血清總IgE水平。

對皮膚樣本進(jìn)行H&E染色，進(jìn)行組織病理學(xué)評估（包括結(jié)痂、增生、細(xì)胞浸潤等）。

通過qPCR檢測皮膚組織中IL-4,IL-5,IL-13的基因表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究表明，暴露于NIV能直接刺激抗原呈遞細(xì)胞的功能。其機(jī)制是通過激活MAPK信號通路（ERK1/2,p-38,JNK），促進(jìn)TNFα的產(chǎn)生。在AD小鼠模型中，口服暴露于接近觀察到的不良反應(yīng)水平（LOAEL）的NIV（5 ppm），會增強(qiáng)局部淋巴結(jié)中樹突狀細(xì)胞的增殖和Th2型細(xì)胞因子（IL-4,IL-5,IL-13）的分泌，從而加劇AD的臨床癥狀、皮膚增厚和皮膚屏障功能損傷。研究結(jié)果提示，NIV可能通過作用于抗原呈遞細(xì)胞，成為加劇特應(yīng)性皮炎的潛在環(huán)境因素。

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