基于經皮水分流失測量的本維莫德抑制特應性皮炎小鼠屏障功能研究進展

2024年7月，Takatsuki藥物研究中心實驗室Toshiki研究團隊，在《BPB Reports》期刊發(fā)表了題為“Tapinarof, a Novel Topical Therapeutic Aryl Hydrocarbon Receptor Agonist, Suppresses Atopic Dermatitis-like Skin Inflammation in Mice"的研究論文。該研究圍繞非甾體小分子芳香烴受體（AhR）激動劑本維莫德展開，探究了其藥理特性，以及在2,4-二硝基氟苯（DNFB）誘導的特應性皮炎（AD）樣皮膚炎癥小鼠模型中的應用效果。

摘要

本維莫德是一種非甾體類小分子芳香烴受體（AhR）激動劑，目前正被研發(fā)用于特應性皮炎（AD）。特應性皮炎是由2型輔助性T（Th2）細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，其特征為表皮分化受損和皮膚屏障功能障礙。有研究表明，本維莫德可通過激活芳香烴受體調控靶基因表達，改善皮膚屏障功能并發(fā)揮抗氧化作用。本研究探討了本維莫德的藥理特性，以及其在2,4-二硝基氟苯誘導的特應性皮炎樣皮膚炎癥小鼠中的療效。在經T細胞激活劑刺激的人外周血單個核細胞中，本維莫德可誘導芳香烴受體激活的標志物細胞色素P4501A1（CYP1A1）的mRNA表達，也能誘導抗氧化酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化還原酶（NQO1）的mRNA表達，同時抑制Th2細胞因子白細胞介素-4（IL-4）的產生。在特應性皮炎樣皮炎小鼠中，局部應用本維莫德可促進皮膚中Cyp1a1和Nqo1的表達，抑制IL-4的產生、耳廓腫脹及組織病理學改變，還能抑制作為皮膚屏障功能指標的經皮水分流失（TEWL）升高。這些結果表明，本維莫德可抑制特應性皮炎樣皮膚炎癥，其作用機制可能涉及抗氧化、抑制Th2細胞因子產生以及改善皮膚屏障功能等多種藥理作用。

實驗材料與儀器

實驗材料

1. 化合物：本維莫德、他克莫司一水合物、二甲基亞砜（DMSO）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素G、鏈霉素；Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28；佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯；植物血凝素-L

2. 細胞：冷凍保存的人外周血單個核細胞

3. 實驗動物：6周齡雌性BALB/c小鼠

使用儀器

數字測厚儀、ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀、實時熒光定量PCR系統(tǒng)、光學顯微鏡（用于組織病理切片觀察）

實驗過程

本研究分為體外人外周血單個核細胞實驗和體內DNFB誘導的小鼠特應性皮炎樣皮炎模型實驗兩部分，同時結合逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、組織病理學檢查及相應統(tǒng)計學分析，具體過程如下：

體外人外周血單個核細胞（PBMCs）實驗

1. 復蘇凍存的人PBMCs，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，以2×10?個細胞/孔接種于96孔板，加入2.0×10?個磁珠/孔的CD3/CD28 T細胞激活劑刺激2天，再加入不同濃度本維莫德繼續(xù)培養(yǎng)24小時，后續(xù)用RNeasy Mini Kit提取總RNA，通過RT-qPCR檢測CYP1A1和NQO1的mRNA表達。

2. 以相同方式接種PBMCs，加入PMA和PHA-L刺激，同時加入不同濃度的本維莫德，培養(yǎng)48小時后收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測IL-4水平；通過CellTiter-Glo 2.0 Assay檢測細胞活力。

實驗動物飼養(yǎng)與模型構建

1. 6周齡雌性BALB/c小鼠適應性喂養(yǎng)1周后用于實驗。

2. 采用DNFB誘導小鼠特應性皮炎樣皮炎：將25 μL 0.15% DNFB（丙酮/橄欖油3:1溶解）涂抹于小鼠左耳雙側，每3-4天一次，共15天內涂抹5次，構建半抗原誘導的慢性皮炎模型。

體內小鼠給藥與指標檢測

1. 給藥方式：從DNFB涂抹當天開始，每日一次將20 μL/只的賦形劑（乙醇）、不同濃度本維莫德（0.01%、0.1%、1%）或0.1%他克莫司涂抹于小鼠左耳雙側，持續(xù)給藥15天。

2. 耳廓腫脹檢測：在第1、2、8、9、15、16天用數字測厚儀測量小鼠左耳厚度，計算與基線的差值，作為耳廓腫脹指標。

3. 經皮水分流失（TEWL）檢測：第16天測量耳廓厚度后，用ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀檢測小鼠耳部皮膚的TEWL，評估皮膚屏障功能。

ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀

小鼠耳部皮膚的TEWL

4. 樣本收集與檢測：第16天檢測完成后，麻醉并處死小鼠，取左耳分為三部分，分別用于基因表達、細胞因子檢測和組織病理學評估。

組織病理學檢查標準

對HE染色的耳部切片中心區(qū)域進行光學顯微鏡觀察，從真皮炎癥細胞浸潤、表皮角化過度、痂皮形成三個維度，按“-（無）、±（極輕微）、+（輕微）、2+（中度）、3+（重度）"的標準進行分級評分。

實驗結論

1. 本維莫德可在人外周血單個核細胞中激活芳香烴受體（AhR）通路，顯著上調CYP1A1和抗氧化基因NQO1的mRNA表達，同時以濃度依賴的方式抑制Th2細胞因子IL-4的產生，表明其在體外具有抗氧化和抑制Th2細胞活化的作用。

2. 在DNFB誘導的小鼠特應性皮炎樣皮炎模型中，局部應用0.01%及以上濃度的本維莫德可抑制小鼠耳廓腫脹，降低經皮水分流失（TEWL），改善皮膚屏障功能，且效果與陽性藥0.1%他克莫司相當。

3. 組織病理學結果顯示，本維莫德可劑量依賴性地減輕小鼠耳部皮膚的真皮炎癥細胞浸潤、表皮角化過度和痂皮形成等病理改變，緩解特應性皮炎樣皮膚炎癥。

4. 本維莫德可在小鼠病變皮膚中激活AhR通路，上調Cyp1a1和Nqo1的mRNA表達，同時抑制耳部組織中IL-4的升高，提示其通過激活AhR通路發(fā)揮抗Th2炎癥、抗氧化作用，這是其抑制特應性皮炎樣炎癥的重要機制。

5. 特應性皮炎患者皮膚中CYP1A1表達降低、AhR表達升高，而低濃度（0.01%）本維莫德即可將小鼠病變皮膚中Cyp1a1和Nqo1的表達恢復至正常水平，說明低劑量局部應用本維莫德即可在皮膚組織中達到有效濃度，發(fā)揮作用。

6. 本維莫德的藥理作用與現有糖皮質激素、鈣調磷酸酶抑制劑等特應性皮炎藥物不同，其兼具改善皮膚屏障功能、抗氧化和抑制2型炎癥的作用，尤其適用于對現有藥物無應答或應答不佳的患者。

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