Omegawave激光散斑血流成像儀在大鼠頜下腺和舌下腺血流量監(jiān)測中的應(yīng)用

該研究由 Toshiya Sato 團(tuán)隊(duì)開展，并發(fā)表在《American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology》期刊上。

研究以烏拉坦麻醉的大鼠（即氨基甲酸乙酯）為實(shí)驗(yàn)對象，對其舌神經(jīng)（LN）中樞切斷端進(jìn)行電刺激，同時檢測其頜下腺血流量（SMGBF）和舌下腺血流量（SLGBF），旨在探究大鼠頜下腺與舌下腺在副交感神經(jīng)血管舒張控制方面的差異。

摘要

本研究采用激光散斑成像血流儀，在烏拉坦麻醉的大鼠中，通過對舌神經(jīng)中樞切斷端進(jìn)行電刺激，檢測了大鼠頜下腺血流量（SMGBF）和舌下腺血流量（SLGBF）的變化。結(jié)果顯示，舌神經(jīng)刺激可引起頜下腺血流量和舌下腺血流量呈強(qiáng)度依賴性和頻率依賴性增加，且頜下腺血流量增加的幅度大于舌下腺血流量。靜脈注射自主神經(jīng)膽堿能神經(jīng)節(jié)阻滯劑六甲銨（hexamethonium），可顯著抑制兩種腺體血流量的增加?？苟巨A藥物阿托品（atropine）能顯著抑制頜下腺血流量的增加，對舌下腺血流量的增加則僅有部分抑制作用。在使用阿托品的情況下，血管活性腸肽（VIP）受體拮抗劑可顯著抑制阿托品未能阻斷的那部分舌下腺血流量增加，而單獨(dú)使用血管活性腸肽受體拮抗劑則無此效果。舌神經(jīng)刺激后，腺體血流量恢復(fù)至基礎(chǔ)水平所需的時間比注射血管活性腸肽后更短。然而，注射阿托品后，舌神經(jīng)刺激導(dǎo)致的腺體血流量恢復(fù)時間會呈劑量依賴性顯著延長，最終與注射血管活性腸肽后的恢復(fù)時間達(dá)到同一水平。

本研究結(jié)果表明：1）舌神經(jīng)刺激可引起副交感神經(jīng)介導(dǎo)的頜下腺血流量增加（主要由膽堿能纖維引發(fā)）和副交感神經(jīng)介導(dǎo)的舌下腺血流量增加（由膽堿能纖維和非膽堿能纖維共同引發(fā)）；2）血管活性腸肽能機(jī)制參與非膽堿能纖維介導(dǎo)的舌下腺血流量增加，且在毒蕈堿能機(jī)制失活時被激活。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)動物：11-16 周齡、體重 325-490g 的雄性Wistar大鼠。

2. 藥物：urethane（烏拉坦）、泮庫溴銨、硫酸阿托品、血管活性腸肽受體拮抗劑、溴化乙酰膽堿、血管活性腸肽、無菌生理鹽水。

3. 氣體：50:50 的空氣與氧氣混合氣體。

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

1. 血管插管相關(guān)器械：用于股靜脈和股動脈插管的器械。

2. 人工通氣設(shè)備：呼吸機(jī)、氣管插管、紅外線分析儀。

3. 血流監(jiān)測儀器：Omegawave OZ-1激光散斑血流成像儀（用于監(jiān)測頜下腺和舌下腺血流量，獲取高分辨率二維血流圖像）。

4. 神經(jīng)刺激儀器：雙極銀電極、電刺激器（對舌神經(jīng)中樞切斷端進(jìn)行電刺激）、雙目顯微鏡（分離舌神經(jīng)）。

5. 生理參數(shù)監(jiān)測儀器：用于監(jiān)測全身動脈血壓（SABP）和心率（HR）的設(shè)備。

實(shí)驗(yàn)過程

（一）動物準(zhǔn)備

（二）激光散斑血流成像

將麻醉后的大鼠置于水平位置，把頜下腺和舌下腺放在黑色聚氨酯墊上，使用Omegawave OZ-1激光散斑血流成像儀的 780nm 半導(dǎo)體激光器對其進(jìn)行漫射照明。散射光經(jīng)過濾后，由位于頸部上方的電荷耦合器件（CCD）相機(jī)檢測。記錄與移動紅細(xì)胞數(shù)量和速度相關(guān)的原始散斑圖像，并傳輸至計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。

Omegawave OZ-1激光散斑血流成像儀

電刺激左側(cè)舌神經(jīng)（LN）中樞切斷端對雙側(cè)下頜下腺（SMG）和舌下腺（SLG）血流的影響

A：照片顯示雙側(cè)下頜下腺（SMG）和舌下腺（SLG）置于黑色烏拉坦墊上，以及刺激前（靜息狀態(tài)）、舌神經(jīng)（LN）刺激開始后 12 秒和 20 秒時的典型散斑圖像時間序列。

B：雙側(cè)下頜下腺（SMG）和舌下腺（SLG）的血流（au，任意單位）、血管傳導(dǎo)性（VC）以及全身動脈血壓（SABP）變化的典型示例。

C：雙側(cè)舌下腺（SLG，實(shí)心柱）和下頜下腺（SMG，空心柱）血管傳導(dǎo)性（VC）變化的平均值（±SE，標(biāo)準(zhǔn)誤）（n=8，樣本量為 8）。采用方差分析后進(jìn)行 Tukey 檢驗(yàn)，評估血管傳導(dǎo)性（VC）變化間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。*P<0.01（差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

（三）舌神經(jīng)電刺激

在雙目顯微鏡下分離左側(cè)舌神經(jīng)（LN），切斷后，用連接到電刺激器的雙極銀電極對其中樞切斷端進(jìn)行電刺激。在每只大鼠中，以不同電壓、不同頻率、2ms脈沖持續(xù)時間對舌神經(jīng)進(jìn)行單側(cè)刺激，每次刺激持續(xù) 20 秒，刺激間隔15分鐘。

（四）藥物作用檢測

1. 所有藥物均用無菌生理鹽水溶解，通過股靜脈給藥。

2. 為檢測舌神經(jīng)電刺激引發(fā)的頜下腺血流量（SMGBF）和舌下腺血流量（SLGBF）增加是否由自主神經(jīng)系統(tǒng)及毒蕈堿受體、血管活性腸肽受體介導(dǎo)，分別進(jìn)行以下操作：

? 靜脈注射 10mg/kg 六甲銨溴化物，在給藥至少 5 分鐘（待 SMGBF、SLGBF 和 SABP 達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)）后，檢測舌神經(jīng)刺激引發(fā)的血流變化，以相同體積生理鹽水作為對照。

? 用注射泵以 2ml/h 的流速靜脈輸注 0.1mg/ml 硫酸阿托品和 0.2mg/ml 血管活性腸肽受體拮抗劑，輸注開始至少 10 分鐘后，檢測舌神經(jīng)刺激引發(fā)的血流變化。

（五）舌下腺血流量增加的時間進(jìn)程分析

對左側(cè)舌神經(jīng)中樞切斷端用 20V、20Hz、2ms 脈沖持續(xù)電刺激 20 秒，或靜脈注射 100ng/kg 溴化乙酰膽堿（ACh）、10ng/kg 血管活性腸肽（VIP），引發(fā)舌下腺血流量（SLGBF）增加。靜脈注射不同劑量（1-100μg/kg）的硫酸阿托品（體積 0.1ml），以相同體積生理鹽水作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 舌神經(jīng)（LN）刺激可引起頜下腺血流量（SMGBF）和舌下腺血流量（SLGBF）呈強(qiáng)度依賴性和頻率依賴性增加，且頜下腺血流量增加幅度大于舌下腺血流量，同時全身動脈血壓（SABP）顯著升高，心率（HR）無顯著變化，且同側(cè)腺體血流量增加顯著大于對側(cè)，表明這種血流量增加并非由血壓變化被動引起，而是 “血管舒張" 作用的結(jié)果。

2. 靜脈注射自主神經(jīng)膽堿能神經(jīng)節(jié)阻滯劑六甲銨，可顯著抑制頜下腺和舌下腺血流量的增加，說明舌神經(jīng)刺激引發(fā)的兩種腺體血流量增加主要由副交感神經(jīng)介導(dǎo)。

3. 抗毒蕈堿藥物阿托品能顯著抑制頜下腺血流量增加，對舌下腺血流量增加僅部分抑制，且單獨(dú)使用血管活性腸肽（VIP）受體拮抗劑對兩種腺體血流量增加無影響，但在使用阿托品的情況下，血管活性腸肽受體拮抗劑可顯著抑制阿托品未能阻斷的那部分舌下腺血流量增加，表明頜下腺血流量增加主要由膽堿能纖維引發(fā)，舌下腺血流量增加由膽堿能纖維和非膽堿能纖維共同引發(fā)，且血管活性腸肽能機(jī)制參與非膽堿能纖維介導(dǎo)的舌下腺血流量增加。

4. 舌神經(jīng)刺激后腺體血流量恢復(fù)至基礎(chǔ)水平的時間比注射血管活性腸肽后更短，而注射阿托品后，舌神經(jīng)刺激導(dǎo)致的腺體血流量恢復(fù)時間呈劑量依賴性顯著延長，最終與注射血管活性腸肽后的恢復(fù)時間一致，說明在毒蕈堿能機(jī)制失活時，血管活性腸肽能機(jī)制被激活，且舌下腺血流量增加的機(jī)制會從膽堿能向血管活性腸肽能轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變依賴于毒蕈堿受體的激活狀態(tài)。

5. 該研究結(jié)果與以往關(guān)于大鼠頜下腺副交感神經(jīng)血管舒張的報(bào)道一致（頜下腺副交感神經(jīng)介導(dǎo)的血流量增加主要由膽堿能纖維引發(fā)），同時發(fā)現(xiàn)舌下腺存在膽堿能和非膽堿能纖維共同介導(dǎo)的血流量增加，且推測在大鼠唾液腺副交感神經(jīng)血管運(yùn)動神經(jīng)中可能存在毒蕈堿自身受體，其在舌下腺中可負(fù)向調(diào)節(jié)血管活性腸肽的釋放，而在頜下腺中無此作用，這可能在口腔面部區(qū)域血液動力學(xué)調(diào)節(jié)中具有重要意義（當(dāng)乙酰膽堿釋放受抑制時）。

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