VAPOSCAN經皮水分流失測量儀助力雪腐鐮刀菌加劇小鼠特應性皮炎的研究

2024年4月麻布大學的Tomoki Fukuyama研究團隊在《Archives of Toxicology》（IF=6.9）期刊上發(fā)表了一篇題為“Sub-acute oral exposure to lowest observed adverse effect level of nivalenol exacerbates atopic dermatitis in mice via direct activation of mitogen-activated protein kinase signal in antigen-presenting cells"的文獻。研究聚焦于B型單端孢霉烯族真菌毒素——雪腐鐮刀菌烯醇的免疫毒性，通過體外細胞實驗和小鼠體內實驗，探究了亞急性經口暴露于觀察有害作用水平的NIV對特應性皮炎的影響及分子機制，明確了NIV通過直接激活抗原呈遞細胞中的絲裂原活化蛋白激酶信號通路加劇小鼠特應性皮炎的作用機制。

摘要

本研究利用抗原呈遞細胞和特應性皮炎小鼠模型，探究了真菌毒素雪腐鐮刀菌烯醇的免疫毒性作用。體外實驗采用小鼠巨噬細胞系和小鼠樹突狀細胞系，將細胞暴露于0.19-5 µmol/L的NIV中24小時后，對促炎細胞因子的產生量進行定量分析。為進一步探究炎癥細胞因子的產生通路，通過MAPK抑制劑和磷酸化分析，研究了ERK1/2、p-38和JNK等絲裂原活化蛋白激酶通路在NIV暴露中的可能作用。此外，在半抗原誘導的AD模型中，評估了低濃度NIV經口暴露的促炎效應。

體外實驗結果顯示，NIV暴露增強了TNFα的產生，且直接誘導了MAPK的磷酸化——MAPK抑制劑預處理后TNFα產生受到抑制，證實了這一通路的參與。與溶劑對照組相比，NIV經口暴露加劇了AD癥狀，包括耳淋巴結中輔助性T細胞和產生IgE的B細胞數(shù)量明顯增加，以及IL-4、IL-5和IL-13等促炎細胞因子的分泌增強。研究結果表明，NIV暴露直接增強了ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，導致抗原呈遞細胞中TNFα產生增加，這與特應性皮炎的發(fā)生發(fā)展密切相關。

實驗材料與儀器

材料

雪腐鐮刀菌烯醇、二甲基亞砜、丙酮、培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、混合液、抗磷酸化ERK、抗ERK、抗磷酸化p-38、抗p-38、抗磷酸化JNK、抑制劑、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、滅菌大麥培養(yǎng)基、10%福爾馬林溶液、蘇木精-伊紅染色液、革蘭氏染色液等。

細胞系：小鼠樹突狀細胞系、小鼠巨噬細胞系。

實驗動物：7周齡雌性NC/Nga小鼠。

實驗儀器

96孔/12孔培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)箱、酶標儀、實時熒光定量PCR系統(tǒng)、SDS-PAGE電泳裝置、轉印系統(tǒng)、蛋白成像系統(tǒng)、流式細胞儀、ASCH VAPOSCAN 經皮水分流失測量儀、細胞計數(shù)系統(tǒng)、珠磨式均質器、石蠟包埋機、切片機。

ASCH VAPOSCAN 經皮水分流失測量儀

實驗過程

體外細胞實驗

1. 細胞培養(yǎng)與NIV暴露：DC2.4細胞接種于含10% FCS和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，RAW264.7細胞接種于含相同添加劑的DMEM培養(yǎng)基，均在適宜條件下培養(yǎng)至70%匯合度。將兩種細胞（1×10?細胞/100 μL）接種到96孔或12孔板，分別暴露于0.19-5 µmol/L的NIV中，培養(yǎng)2、4或24小時，提前進行細胞毒性試驗確認無細胞毒性。

2. 炎癥細胞因子檢測：培養(yǎng)24小時后，收集細胞上清液，采用ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-6和TNFα的分泌水平，通過酶標儀測定吸光度值。

3. 促炎細胞因子基因表達分析：采用NucleoSpin® RNA試劑盒提取細胞總RNA（500 ng），經PrimeScript™ RT Master Mix逆轉錄為cDNA，以β-肌動蛋白為內參基因，通過實時熒光定量PCR檢測IL-1β、IL-6和TNFα的基因表達水平（采用2?ΔΔCt法計算）。

4. MAPK磷酸化檢測：NIV暴露2小時后，采用M-PER™試劑提取細胞總蛋白（10-30 µg），經SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，加入一抗（抗磷酸化ERK、p-38、JNK等）和二抗孵育，通過ImmunoStar® Zeta試劑顯色，利用蛋白成像系統(tǒng)檢測并定量磷酸化蛋白水平。

5. MAPK抑制劑實驗：在NIV暴露前1小時，向細胞中加入1 µmol/L的ERK1/2、p38或JNK抑制劑預處理，培養(yǎng)24小時后通過ELISA檢測TNFα的產生量，驗證MAPK通路的作用。

體內動物實驗

1. AD小鼠模型建立與NIV暴露：實驗第1周，將5% TDI的丙酮溶液局部涂抹于脫毛的小鼠背部皮膚和耳廓進行致敏；隨后4周內，每周局部涂抹0.5% TDI進行激發(fā)。同時，通過飲用水每日給予小鼠1 ppm、5 ppm NIV（為驗證重現(xiàn)性和中間濃度效應，額外設置2.5 ppm NIV組）。

2. 皮膚相關指標監(jiān)測：實驗期間每周檢測一次經皮水分流失（TEWL）、耳和背部皮膚厚度，采用0-4分制評估AD癥狀（0分為無癥狀，4分為極嚴重癥狀）。

經表皮水分流失（TEWL）

3. 樣本收集：致敏4周后，收集小鼠背部皮膚、耳淋巴結（LN）和血清樣本。

4. 免疫細胞分析：制備耳淋巴結單細胞懸液，經小鼠Fc封閉劑處理后，加入特異性單克隆抗體孵育，通過流式細胞儀分析CD11c?CD40?樹突狀細胞、CD3?CD4?輔助性T細胞、CD19?IgE? B細胞等免疫細胞數(shù)量。

5. 細胞因子與IgE檢測：將淋巴結單細胞懸液（5×10?細胞/孔）與Dynabeads小鼠T細胞激活劑CD3/CD28共孵育24或96小時，通過ELISA檢測上清液中IL-4、IL-5和IL-13的水平；采用ELISA試劑盒測定血清總IgE水平。

6. 組織病理學評估：將皮膚樣本固定于10%福爾馬林溶液，石蠟包埋后切成5 μm切片，進行蘇木精-伊紅染色或革蘭氏染色，采用盲法按0-3分制（0為正常，3為嚴重）評估表皮增生、結痂、細胞浸潤、潰瘍等病理變化。

7. 皮膚組織RNA分析：采用珠磨式均質器破碎冷凍皮膚組織，提取總RNA并逆轉錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測IL-4、IL-5和IL-13的基因表達水平（以β-肌動蛋白為內參）。

統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，多組間比較采用方差分析后進行Dunnett多重比較檢驗，兩組間比較采用非配對t檢驗，以p<0.05和p<0.01為差異具有統(tǒng)計學意義，使用GraphPad Prism 10軟件進行數(shù)據(jù)分析。

實驗結論

1. 體外實驗中，NIV暴露對DC2.4細胞的IL-1β和IL-6產生無明顯影響，但增強了DC2.4和RAW264.7細胞中TNFα的產生及基因表達；5 μmol/L NIV可增強RAW264.7細胞的IL-1β產生，但對其IL-6的產生和基因表達無影響。

2. NIV暴露以劑量依賴方式誘導DC2.4細胞中ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，且特異性MAPK抑制劑可抑制NIV誘導的TNFα產生，證實NIV通過激活MAPK通路促進促炎細胞因子分泌。

3. 體內實驗中，5 ppm NIV經口暴露增加了AD模型小鼠耳淋巴結中2型常規(guī)樹突狀細胞數(shù)量，輔助性T細胞和IgE陽性B細胞數(shù)量呈增加趨勢；同時增強IL-4、IL-5和IL-13等Th2相關促炎細胞因子的分泌，但對血清總IgE水平無明顯影響；2.5 ppm NIV組也呈現(xiàn)類似的樹突狀細胞增殖和細胞因子釋放增強效應。

4. 5 ppm NIV暴露加劇了小鼠AD癥狀，增加皮膚厚度和經皮水分流失，皮膚組織病理學顯示表皮結痂、非角化層增生和潰瘍癥狀加重；2.5 ppm NIV暴露可增加經皮水分流失，但對耳皮膚厚度無明顯影響；NIV暴露對皮膚組織中IL-4、IL-5和IL-13的基因表達無明顯影響。

5. 核心結論：NIV暴露通過直接激活抗原呈遞細胞中的ERK1/2、p-38和JNK MAPK信號通路，促進TNFα產生，進而增強局部免疫炎癥反應，最終加劇特應性皮炎癥狀，提示NIV可能是特應性皮炎發(fā)生發(fā)展的潛在風險因子。

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