ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀助力感覺神經(jīng)在皮膚屏障修復(fù)中的作用研究

2024年3月京都大學(xué)醫(yī)學(xué)院的中嶋千紗團(tuán)隊在《Journal of Allergy and Clinical Immunology》（IF:14.2）上發(fā)表了題為“TRPV1-positive sensory nerves and neuropeptides are involved in epidermal barrier repair after tape stripping in mice"的研究文獻(xiàn)。研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究了感覺神經(jīng)在膠帶剝離誘導(dǎo)的表皮損傷后皮膚屏障修復(fù)中的具體作用，明確了TRPV1陽性感覺神經(jīng)及相關(guān)神經(jīng)肽在這一過程中的調(diào)控機(jī)制，同時揭示了生長抑素對白細(xì)胞介素6（IL-6）誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞分化下調(diào)的保護(hù)作用。

摘要

皮膚的表皮系統(tǒng)是一道重要的保護(hù)屏障，角質(zhì)層處于這道屏障的最外層，由能生物合成絲聚蛋白的角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成，絲聚蛋白是維持皮膚健康的關(guān)鍵成分。然而，與傷口愈合過程不同，感覺神經(jīng)在膠帶剝離誘導(dǎo)的表皮損傷后皮膚屏障修復(fù)中的具體作用，至今仍是一個未解之謎。

本研究旨在闡明感覺神經(jīng)在膠帶剝離誘導(dǎo)的表皮損傷后表皮屏障修復(fù)中的潛在作用。研究人員通過構(gòu)建樹脂毒素（RTX）處理的去神經(jīng)小鼠模型，探究了膠帶剝離后小鼠皮膚屏障修復(fù)的動力學(xué)特征，并對小鼠皮膚或背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行免疫表型分析和基因表達(dá)分析，以篩選潛在的相關(guān)神經(jīng)肽；同時評估了候選神經(jīng)肽對小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞及RTX處理小鼠皮膚屏障恢復(fù)的功能影響。

結(jié)果顯示，消融TRPV1陽性感覺神經(jīng)會減緩小鼠皮膚屏障的修復(fù)進(jìn)程，并導(dǎo)致皮下炎癥持續(xù)存在，同時膠帶剝離后小鼠耳組織勻漿中的IL-6水平明顯升高；與對照組小鼠相比，RTX處理的小鼠耳皮膚中角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)志物Flg的表達(dá)降低。經(jīng)神經(jīng)肽篩選發(fā)現(xiàn)，生長抑素或奧曲肽可逆轉(zhuǎn)IL-6介導(dǎo)的Flg表達(dá)下調(diào)；此外，給予奧曲肽的RTX處理小鼠，其膠帶剝離后的皮膚屏障修復(fù)得到部分改善。

研究結(jié)論為，表達(dá)TRPV1的感覺神經(jīng)元在表皮損傷后的屏障功能恢復(fù)中發(fā)揮著重要的作用，本研究結(jié)果提示生長抑素可能參與了皮膚損傷后的表皮修復(fù)過程。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器列舉

實(shí)驗(yàn)動物

4-12周齡雌性C57BL/6J小鼠、6-19周齡雌雄不限的Nav1.8-Cre R26-CAG-LoxP-EGFP-TeNT小鼠；Nav1.8-Cre小鼠、R26 CAG-LF-EGFP-TeNT小鼠、ACTB-FLPe小鼠。

實(shí)驗(yàn)試劑

辣椒素、樹脂毒素、奧曲肽醋酸鹽、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽、甘丙肽、生長抑素、dispase II、0.05%胰蛋白酶-EDTA、角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基2、溴脫氧尿苷、白細(xì)胞介素6、1.3 mM氯化鈣、TRIzol試劑、RNeasy Mini試劑盒、Prime Script RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I Master、Bio-Plex細(xì)胞裂解試劑盒、Micro BCA蛋白測定試劑盒。

實(shí)驗(yàn)儀器

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、pH計、LightCycler 480 Instrument II熒光定量PCR儀、FastPrep-24組織勻漿系統(tǒng)、Bio-Plex細(xì)胞因子檢測平臺、增殖酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測相關(guān)設(shè)備、膠原包被的96孔板、24孔板、超低溫冰箱。

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

實(shí)驗(yàn)過程

本研究整體圍繞動物模型構(gòu)建、皮膚屏障損傷造模、分子檢測、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)四大核心環(huán)節(jié)展開，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1. TRPV1陽性感覺神經(jīng)去神經(jīng)小鼠模型構(gòu)建：對小鼠背部皮下注射梯度劑量的RTX（30、70、100 mg/kg），連續(xù)注射3天，對照組小鼠注射溶媒（含0.01%乙醇的PBS）；造模后讓小鼠休息至少3周，通過辣椒素誘導(dǎo)的眼部擦拭實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證去神經(jīng)效果，若小鼠無傷害性擦拭行為，表明TRPV1陽性感覺神經(jīng)消融成功。

2. 膠帶剝離誘導(dǎo)小鼠皮膚表皮屏障損傷：使用Nichiban玻璃紙膠帶對小鼠左耳腹側(cè)進(jìn)行連續(xù)膠帶剝離，直至經(jīng)皮水分流失（TEWL）值達(dá)到60.0~90.0 g/m2·h；對于奧曲肽治療組，在膠帶剝離后立即對RTX處理小鼠皮下注射奧曲肽（100 mg/kg，每日兩次），持續(xù)5天，對照組注射PBS。

3. 皮膚屏障功能指標(biāo)檢測：在膠帶剝離后的不同時間點(diǎn)，檢測小鼠皮膚的TEWL值和皮膚表面pH，作為表皮屏障功能恢復(fù)的評價指標(biāo)；同時在各時間點(diǎn)收集小鼠耳組織和背根神經(jīng)節(jié)，速凍后用于后續(xù)分析。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：小鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)與檢測

分離成年對照組和RTX處理小鼠的耳皮膚，經(jīng)dispase II和胰蛋白酶-EDTA消化后，獲得原代角質(zhì)形成細(xì)胞，接種于膠原包被板，在KGM2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用于增殖和分化實(shí)驗(yàn)；同時分離出生24小時內(nèi)新生小鼠的皮膚制備原代角質(zhì)形成細(xì)胞，用于神經(jīng)肽篩選實(shí)驗(yàn)。

增殖實(shí)驗(yàn)：將角質(zhì)形成細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)48小時后加入溴脫氧尿苷繼續(xù)培養(yǎng)24小時，通過ELISA試劑盒檢測溴脫氧尿苷的摻入量，評估細(xì)胞增殖能力。

分化實(shí)驗(yàn)：將角質(zhì)形成細(xì)胞用含1.3 mM CaCl?的高鈣培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，其中成年小鼠細(xì)胞分化3天，新生小鼠細(xì)胞分化5天；新生小鼠細(xì)胞分化的最后2天，在培養(yǎng)基中加入IL-6及不同神經(jīng)肽（PACAP、甘丙肽、生長抑素、奧曲肽，濃度均為1mM），最終通過定量PCR檢測角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)志物Flg的mRNA表達(dá)。

5. 分子水平檢測

定量RT-PCR分析：提取小鼠耳組織和背根神經(jīng)節(jié)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用SYBR Green法進(jìn)行定量PCR，檢測炎癥細(xì)胞因子、神經(jīng)肽及受體、屏障相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，以核糖體蛋白Rplp1為內(nèi)參基因，通過2^(-ΔCt)法計算基因相對表達(dá)量。

細(xì)胞因子定量：將速凍的小鼠耳組織用含蛋白酶抑制劑的裂解液勻漿，經(jīng)離心取上清，通過Bio-Plex平臺檢測IL-5、IL-6、IL-13的蛋白水平，并用Micro BCA試劑盒測定總蛋白含量對細(xì)胞因子水平進(jìn)行歸一化。

6. 統(tǒng)計學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Pharmaco Basic軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析；經(jīng)F檢驗(yàn)檢驗(yàn)方差齊性后，采用Student t檢驗(yàn)或Welch檢驗(yàn)比較兩組差異；多組比較經(jīng)Bartlett檢驗(yàn)后，采用Dunnett檢驗(yàn)或Steel檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)論

1. TRPV1陽性感覺神經(jīng)的消融會減緩小鼠膠帶剝離后的表皮屏障修復(fù)，表現(xiàn)為TEWL值和皮膚表面pH持續(xù)升高，同時伴隨皮下炎癥的持續(xù)存在，其中IL-6的表達(dá)上調(diào)，且角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)志物Flg的mRNA表達(dá)降低；而Nav1.8-Cre R26-CAG-LoxP-EGFP-TeNT小鼠（C纖維和Aδ纖維感覺神經(jīng)的胞吐被阻斷）也出現(xiàn)TEWL值持續(xù)升高，表明表皮屏障修復(fù)受損是由感覺神經(jīng)元功能障礙導(dǎo)致。

2. 膠帶剝離后，對照組小鼠背根神經(jīng)節(jié)中Adcyap1、Gal、Sst三種神經(jīng)肽的mRNA表達(dá)上調(diào)，且高鈣培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中，PACAP受體Vipr1、甘丙肽受體Galr2、生長抑素受體Sstr2的表達(dá)也上調(diào)，提示這些神經(jīng)肽可能參與表皮損傷后的皮膚屏障修復(fù)。

3. IL-6會導(dǎo)致小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中Flg的mRNA表達(dá)下調(diào)，而生長抑素或其類似物奧曲肽可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，PACAP和甘丙肽則無此作用；同時，奧曲肽可使RTX處理的去神經(jīng)小鼠的TEWL值和皮膚表面pH得到部分改善，實(shí)現(xiàn)皮膚屏障修復(fù)的部分恢復(fù)。

4. 表達(dá)TRPV1的感覺神經(jīng)元在表皮損傷后的皮膚屏障功能恢復(fù)中具有不可替代的作用，而由TRPV1陽性感覺神經(jīng)釋放的神經(jīng)肽生長抑素，可通過拮抗IL-6誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞分化下調(diào)，參與皮膚損傷后的表皮修復(fù)過程。