IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀在刺蒺藜-杜仲藥對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的影響研究

山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院的楊傳華團(tuán)隊(duì)在《中華中醫(yī)藥學(xué)刊》發(fā)表了題為《刺蒺藜-杜仲藥對(duì)逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚的實(shí)驗(yàn)研究》的論文。該研究旨在觀察刺蒺藜-杜仲藥對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的降壓效應(yīng)及其對(duì)高血壓左室肥厚的影響，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

摘要

目的 研究刺蒺藜-杜仲藥對(duì)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）左室肥厚的影響及其可能作用機(jī)制。方法 將21只8周齡雄性SHR隨機(jī)分為刺蒺藜-杜仲藥對(duì)組（22.12gkg?1）、纈沙坦組（13.35mgkg?1）和SHR模型組（0.5%CMC）各7只，另將7只同周齡雄性WKY大鼠作為正常組（0.5%CMC）。各組灌胃給藥，連續(xù)10周。大鼠尾動(dòng)脈血壓計(jì)測(cè)量大鼠收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、平均動(dòng)脈壓（MAP）。超聲心動(dòng)圖分別測(cè)量室間隔厚度（IVST）與左室后壁厚度（LVPWT）、左室舒張末期容積（EDV）、左室收縮末期容積（ESV）、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、每搏輸出量（SV），計(jì)算左室質(zhì)量（LVM）及左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）。取全心稱重，計(jì)算心臟指數(shù)（CI）。左室心肌組織HE染色，病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行心肌細(xì)胞橫徑（CTD）測(cè)量和形態(tài)學(xué)觀察。Western Blot檢測(cè)心肌組織PI3K和PKC的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠SBP、DBP、MAP升高（P<0.01），IVST、LVPWT增厚（P<0.05），CI、LVMI、CTD增加（P<0.05），心肌組織形態(tài)學(xué)有改變，心肌組織PI3K和PKC的蛋白表達(dá)水平增高（P<0.05）；與模型組比較，刺蒺藜-杜仲組和纈沙坦組大鼠SBP、DBP、MAP下降（P<0.05），IVST、LVPWT變薄（P<0.05），CI、LVMI、CTD降低（P<0.05），心肌組織形態(tài)學(xué)改善，心肌組織PI3K和PKC的蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。結(jié)論 刺蒺藜-杜仲藥對(duì)具有逆轉(zhuǎn)SHR左室肥厚的作用，其機(jī)制可能與降低心肌組織PI3K/PKC信號(hào)通路的活性有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性8周齡自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）21只，體質(zhì)量（209±7）g；雄性同周齡WKY（Wistar Kyoto）大鼠7只，體質(zhì)量（210±5）g。

實(shí)驗(yàn)藥物：刺蒺藜、杜仲、纈沙坦膠囊

實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗大鼠PI3K-beta一抗、兔抗大鼠PKC-epsilon一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔多克隆抗體、化學(xué)發(fā)光HRP底物試劑盒WBKLS0050、其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

實(shí)驗(yàn)儀器：IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀、心臟彩色多普勒超聲波診斷系統(tǒng)、數(shù)字成像系統(tǒng)、彩色病理圖文分析系統(tǒng)、電子分析天平、PH計(jì)、Cascada I超純水系統(tǒng)、高速冷凍離心機(jī)。

IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀

研究步驟與流程

動(dòng)物分組及給藥：將21只SHR大鼠隨機(jī)分為3組（各7只），即刺蒺藜-杜仲藥對(duì)組（刺蒺藜-杜仲組）、纈沙坦對(duì)照組（纈沙坦組）、SHR模型組（模型組），7只WKY大鼠為正常組。刺蒺藜-杜仲藥對(duì)組灌胃給藥濃縮液22.12gkg?1；纈沙坦組給予纈沙坦膠囊13.35mgkg?1；SHR模型組和正常組給予等量生理鹽水。各組動(dòng)物于每晚19:00灌胃給藥1次，每周給藥6d，連續(xù)10周。每周將大鼠裝入測(cè)量盒內(nèi)，以電子天平測(cè)量體質(zhì)量（BW），根據(jù)變化隨時(shí)調(diào)整給藥量。

血壓測(cè)量：每周二上午8:00-10:30采用IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀對(duì)大鼠尾動(dòng)脈加壓法測(cè)量大鼠血壓，測(cè)量時(shí)尾部加溫至32℃，波形穩(wěn)定后測(cè)量收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、平均動(dòng)脈壓（MAP）。連續(xù)重復(fù)測(cè)量3次，每次間隔約3min，取3次測(cè)量的平均值作為血壓值，以mmHg（1mmHg=0.133kPa）表示。

超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：末次給藥后將大鼠用3%40mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，心前區(qū)備皮。M超聲分別測(cè)量室間隔厚度（IVST）與左室后壁厚度（LVPWT）、左室舒張末期容積（EDV）、左室收縮末期容積（ESV）、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、每搏輸出量（SV）。計(jì)算左室質(zhì)量（LVM）及左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）。Deiereux左室質(zhì)量（LVM）校正公式：LVM = 0.8×1.04×[(IVSd + LVEdd + LVPWd)3 - LVEdd3] + 0.6。左心室質(zhì)量指數(shù)計(jì)算公式：LVM = LVM/BW。

左室質(zhì)量指數(shù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后打開大鼠胸腔，取出心臟稱重為心臟質(zhì)量（HW）；計(jì)算心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值為心臟指數(shù)（CI）。

心肌細(xì)胞橫徑與形態(tài)學(xué)觀察：取大鼠左室中段心肌組織，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下進(jìn)行左室心肌組織形態(tài)學(xué)觀察并測(cè)量心肌細(xì)胞橫徑（CTD）。

Western Blot檢測(cè)：心肌組織剪碎，加入預(yù)冷的含1% PMSF的RIPA裂解液，低溫裂解5min，12000r/min離心15min，提取總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。12% SDS-PAGE電泳，上樣量50μg，電轉(zhuǎn)印后以含5%脫脂奶的PBS-T室溫封閉1h。加入兔抗大鼠PI3K一抗（1:300稀釋）或PKC一抗（1:500稀釋），以β-actin為內(nèi)參，4℃孵育過夜。次日1×PBS-T洗滌5min×5次，加入山羊抗兔IgG二抗（1:20000）室溫孵育1h，1×PBS-T洗滌5min×5次?；瘜W(xué)發(fā)光HRP底物顯色，F(xiàn)luorChem Q曝光、條帶半定量分析。

 研究結(jié)果與分析

血壓：與正常組比較，SHR模型組大鼠收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、平均動(dòng)脈壓（MAP）均升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠SBP、DBP、MAP均下降，且刺蒺藜-杜仲組與纈沙坦組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）

超聲心動(dòng)圖：與正常組比較，SHR模型組大鼠IVST、LVPWT增厚（P<0.05），其他超聲心動(dòng)圖指標(biāo)無明顯差異；與模型組比較，纈沙坦組與刺蒺藜-杜仲組IVST、LVPWT均降低（P<0.05），且兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）

心臟指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)及心肌細(xì)胞橫徑：與正常組比較，SHR模型組大鼠CI、LVMI、CTD均增加（P<0.05）；與模型組比較，纈沙坦組與刺蒺藜-杜仲組CI、LVMI、CTD均降低（P<0.05），且兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）

心肌組織形態(tài)學(xué)：正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色均勻，心肌細(xì)胞無變性、壞死，間質(zhì)無明顯增生表現(xiàn)；SHR模型組大鼠可見心肌細(xì)胞排列紊亂，胞漿染色加深，結(jié)構(gòu)不清，部分細(xì)胞內(nèi)心肌纖維斷裂，細(xì)胞體積增大，間質(zhì)中有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維增生；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞體積減小，未見明顯間質(zhì)纖維化表現(xiàn)，偶見細(xì)胞核大小不一。

PI3K/PKC蛋白表達(dá)：Western Blot檢測(cè)SHR心肌組織PI3K和PKC的蛋白表達(dá)水平高于WKY組（P<0.05），各給藥組則均低于SHR組（P<0.05）。

總結(jié)

高血壓累及心臟時(shí)左室負(fù)荷漸進(jìn)加重，激活PI3K/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究觀察發(fā)現(xiàn)刺蒺藜-杜仲藥對(duì)不僅能降低SHR的血壓，而且對(duì)SHR左室重構(gòu)有逆轉(zhuǎn)作用，并且刺蒺藜-杜仲藥對(duì)能夠降低心肌組織PI3K/PKC蛋白表達(dá)。推測(cè)對(duì)PI3K/PKC蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)是刺蒺藜-杜仲藥對(duì)的藥理作用靶點(diǎn)之一。刺蒺藜與杜仲作為臨床研究證實(shí)的降壓藥對(duì)，廣泛用于中藥方劑及中藥復(fù)方制劑當(dāng)中。

參考文獻(xiàn)：

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