ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀助力脂肪膠原片段修復(fù)特應(yīng)性皮炎小鼠研究

2024年10月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院整形外科的盧峰和何運(yùn)凡研究團(tuán)隊(duì)，在《Plastic and Reconstructive Surgery》期刊上發(fā)表了題為“Adipokine-Enriched Adipose Extract Restores Skin Barrier and Ameliorates Inflammatory Dysregulation in Atopic Dermatitis Mice"（富含脂肪因子的脂肪提取物修復(fù)特應(yīng)性皮炎小鼠皮膚屏障并改善炎癥失調(diào)）的研究。聚焦于新型富含脂肪因子的產(chǎn)物——脂肪膠原片段（ACF），通過卵清蛋白誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎（AD）小鼠模型，探究其是否能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和修復(fù)皮膚屏障來緩解AD癥狀。

摘要

背景

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種發(fā)病率較高的慢性皮膚病，其特征為皮膚屏障異常和免疫失調(diào)。傳統(tǒng)療法通常受限于副作用和高成本。鑒于脂肪因子具有抗炎和修復(fù)特性，其日益被認(rèn)為是治療皮膚病的潛在候選藥物。脂肪膠原片段（ACF）作為一種新型富含脂肪因子的產(chǎn)物，可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和修復(fù)皮膚屏障來緩解AD。

方法

采用高速勻漿（10,000轉(zhuǎn)/分鐘，持續(xù)1分鐘）和離心（3000×g，持續(xù)3分鐘）的方法從脂肪組織中提取ACF。將卵清蛋白誘導(dǎo)的AD雌性BALB/c小鼠（6周齡）隨機(jī)分為兩組，分別皮內(nèi)注射0.2 mL ACF（ACF組）或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS組，陰性對(duì)照），同時(shí)設(shè)置正常小鼠作為正常對(duì)照組（n=6）。在AD誘導(dǎo)期結(jié)束后（第50天），評(píng)估皮膚病嚴(yán)重程度、炎癥相關(guān)指標(biāo)（表皮厚度、浸潤的肥大細(xì)胞數(shù)量、輔助性T細(xì)胞（Th）型細(xì)胞因子表達(dá)）以及皮膚屏障相關(guān)指標(biāo)（經(jīng)表皮失水率、皮膚屏障相關(guān)蛋白表達(dá)）。此外，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析評(píng)估ACF中的生物活性成分。

結(jié)果

ACF來源的脂肪因子包含抗炎、皮膚屏障相關(guān)和脂質(zhì)生物合成相關(guān)成分。ACF治療可降低AD皮膚的皮膚病嚴(yán)重程度（6.2±1.8，P<0.0001）、表皮厚度（25.7±12.8μm，P=0.0045）、浸潤的肥大細(xì)胞數(shù)量（31.3±12.4個(gè)/視野，P=0.0475）以及Th型細(xì)胞因子（干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-4R、IL-13和IL-17A，P<0.05）的表達(dá)。同時(shí)，ACF治療還改善了經(jīng)表皮失水率（29.8±13.8g/m2·h，P=0.0306）和皮膚屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)（絲聚蛋白：14,258±4375，P=0.0162；兜甲蛋白：6037±1728，P=0.0010；緊密連接蛋白-1：20,043±6406，P=0.0420；閉合小環(huán)蛋白-1：4494±1114，P=0.0134）。

結(jié)論

ACF通過改善炎癥失調(diào)和皮膚屏障缺陷，在小鼠模型中改善了AD癥狀。該療法需在更高級(jí)的動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡雌性BALB/c小鼠；

2. 主要試劑：卵清蛋白、磷酸鹽緩沖鹽水、Dulbecco改良 Eagle 培養(yǎng)基、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、H&E染色試劑、TB染色試劑、4',6-二脒基-2-苯基吲哚；

3. 抗體：抗絲聚蛋白抗體、抗兜甲蛋白抗體、抗緊密連接蛋白-1抗體、抗閉合小環(huán)蛋白-1抗體、抗細(xì)胞角蛋白16（CK16）抗體及相應(yīng)二抗；

儀器

高速勻漿機(jī)、離心機(jī)、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、Q-Exactive質(zhì)譜儀、Easy nLC液相色譜系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)過程

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)

BALB/c小鼠飼養(yǎng)于25℃無病原體環(huán)境中，采用12小時(shí)光照/黑暗周期，自由進(jìn)食飲水。

2. ACF制備

從每只BALB/c小鼠獲取約1.5g皮下脂肪組織，用PBS（pH7.4）洗滌兩次并切成小塊后，使用高速勻漿機(jī)以10,000轉(zhuǎn)/分鐘勻漿1分鐘，隨后依次通過0.25mm和0.15mm不銹鋼濾網(wǎng)去除大纖維片段。將過濾后的脂肪組織懸液以3000×g離心3分鐘，收集沉淀物即為ACF。

3. OVA誘導(dǎo)AD小鼠模型建立與分組處理

選取12只BALB/c小鼠，麻醉后脫毛，用3M Tegaderm膠帶對(duì)背部皮膚進(jìn)行6次剝離處理，隨后將浸有100μg/100μL OVA/生理鹽水溶液的1×1cm無菌紗布敷于背部皮膚并固定，持續(xù)1周。每只小鼠進(jìn)行三次1周的OVA致敏，間隔為兩周，整個(gè)模型制備周期為49天。在模型制備第28天，將致敏的AD小鼠隨機(jī)分為兩組（每組n=6）：ACF組背部皮膚致敏部位皮內(nèi)注射0.2mL ACF；PBS組注射0.2mL PBS作為陰性對(duì)照；另設(shè)6只未進(jìn)行OVA致敏的小鼠作為正常對(duì)照組（NC組）。

4. 檢測指標(biāo)與方法

• AD癥狀嚴(yán)重程度評(píng)估：第50天，對(duì)紅斑/出血、結(jié)痂/抓痕、滲液/糜爛、腫脹/水腫、干燥、苔蘚樣變6項(xiàng)癥狀進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)評(píng)分范圍為0（無）至3（嚴(yán)重），總分為癥狀嚴(yán)重程度評(píng)分。

• TEWL水平測量：在AD誘導(dǎo)前（第1天）和誘導(dǎo)后（第50天），于室溫濕度條件下，用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀測量小鼠背部皮膚TEWL水平。

ASCH  VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

（左）正常對(duì)照組（NC）、磷酸鹽緩沖液組（PBS）及 ACF 組小鼠背部皮膚的經(jīng)皮水分流失（TEWL）檢測結(jié)果（樣本量 n=6，均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差）。（右）采用 ImageJ 軟件對(duì)免疫組化（IHC）染色圖像進(jìn)行定量分析，獲得的正常對(duì)照組（NC）、磷酸鹽緩沖液組（PBS）及 ACF 組皮膚樣本中絲聚蛋白、兜甲蛋白、閉合蛋白 1 及緊密連接蛋白 1的表達(dá)水平（樣本量 n=10，均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差）。P<0.05；P<0.001；****P<0.0001。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析結(jié)合杜凱檢驗(yàn)，同時(shí)采用**克魯斯卡爾 - 沃利斯檢驗(yàn)。

• 組織學(xué)檢查：第50天將小鼠，取背部皮膚，一半固定于10%福爾馬林溶液中，石蠟包埋后切成4μm切片，進(jìn)行H&E染色（評(píng)估表皮厚度）和TB染色（計(jì)數(shù)浸潤的肥大細(xì)胞），通過ImageJ軟件分析圖像。

• 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）：采用TRIzol試劑提取皮膚組織RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因，通過qPCR檢測Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α）、Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-4R、IL-13）和Th17型細(xì)胞因子（IL-17A）的相對(duì)基因表達(dá)水平。

• 免疫組化（IHC）與免疫熒光染色：對(duì)石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)后，加入相應(yīng)一抗和二抗進(jìn)行IHC染色，通過ImageJ軟件半定量分析絲聚蛋白、兜甲蛋白、緊密連接蛋白-1和閉合小環(huán)蛋白-1的表達(dá)；免疫熒光染色則將CK16抗體與皮膚屏障相關(guān)蛋白抗體共孵育，DAPI染核，通過激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白共定位情況。

• ACF浸出液制備與蛋白質(zhì)組學(xué)分析：將0.3mL ACF置于3mL DMEM中，37℃、5%CO?、95%濕度條件下培養(yǎng)72小時(shí)，3000×g離心3分鐘收集上清液作為ACF浸出液。采用過濾輔助蛋白質(zhì)組制備酶解方法提取肽段，通過Q-Exactive質(zhì)譜儀結(jié)合Easy nLC進(jìn)行質(zhì)譜分析，利用Proteome Discoverer 2.2軟件進(jìn)行蛋白鑒定，Blast2GO軟件進(jìn)行基因本體（GO）注釋分析。

5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA）結(jié)合Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行性分析，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. ACF治療可緩解OVA誘導(dǎo)的AD小鼠模型的皮膚病癥狀，降低癥狀嚴(yán)重程度評(píng)分，其緩解效果優(yōu)于部分傳統(tǒng)療法及脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）療法。

2. ACF能有效減輕AD皮膚的表皮增厚和肥大細(xì)胞浸潤，使表皮厚度基本恢復(fù)至正常水平，減少炎癥細(xì)胞在皮膚組織中的聚集。

3. ACF可下調(diào)AD皮膚中Th1、Th2和Th17型炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，糾正炎癥失調(diào)，且抑制的細(xì)胞因子譜比ADSCs更廣泛。

4. ACF能改善AD皮膚的經(jīng)表皮失水率，上調(diào)絲聚蛋白、兜甲蛋白、緊密連接蛋白-1和閉合小環(huán)蛋白-1等皮膚屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)，修復(fù)受損的皮膚屏障。

5. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析證實(shí)，ACF含有823種脂肪因子，其中包括26種皮膚屏障相關(guān)、37種抗炎相關(guān)和41種脂質(zhì)生物合成相關(guān)脂肪因子，這些成分是ACF發(fā)揮治療作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

6. ACF作為一種自體來源、制備快速簡便、無明顯嚴(yán)重副作用的注射用產(chǎn)物，有望成為解決AD的潛在方法，但需在更大樣本量的動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證，并確定治療劑量后再推進(jìn)至臨床研究。

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