ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀助力苦杏仁苷改善銀屑病實(shí)驗(yàn)研究

作為一種由免疫系統(tǒng)紊亂引發(fā)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，銀屑病的長期干預(yù)一直是科研領(lǐng)域的難題。而苦杏仁苷所具備的免疫調(diào)節(jié)與抗炎性，為這一難題提供了新的解決方向。

2024年12月14日，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)的韓凌研究團(tuán)隊(duì)在《Archives of Dermatological Research》期刊上發(fā)表了題為“Amygdalin alleviates psoriasis-like lesions by improving skin barrier unction"的研究。該研究通過咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型、膠帶剝離誘導(dǎo)的皮膚屏障破壞模型，以及體外IL-17A和TNF-α刺激的HaCaT細(xì)胞模型，探究苦杏仁苷對銀屑病的可能作用及其作用機(jī)制，重點(diǎn)分析其對炎癥反應(yīng)和皮膚屏障功能的影響。

摘要

背景：銀屑病是一種由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病?？嘈尤受站哂忻庖哒{(diào)節(jié)和抗炎作用。

目的：為探究苦杏仁苷對銀屑病的潛在作用及其發(fā)病機(jī)制，本研究檢測了苦杏仁苷對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病、膠帶剝離誘導(dǎo)的皮膚屏障破壞的影響，并在體外探究了其可能的作用機(jī)制。

結(jié)果：在兩種動(dòng)物模型中，苦杏仁苷可減少表皮厚度和炎癥細(xì)胞浸潤，抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，并上調(diào)絲聚蛋白、兜甲蛋白和角蛋白10的表達(dá)。此外，在IL-17A和TNF-α誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中，苦杏仁苷可抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)皮膚屏障修復(fù)相關(guān)蛋白絲聚蛋白、兜甲蛋白和角蛋白10的表達(dá)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)合表明，苦杏仁苷可調(diào)節(jié)銀屑病中的炎癥反應(yīng)和皮膚屏障功能。本研究還進(jìn)行了初步的機(jī)制探索，發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷可抑制p38MAPK信號通路的磷酸化。

結(jié)論：苦杏仁苷能夠緩解銀屑病皮損并改善皮膚屏障損傷，該研究為其未來開發(fā)成為銀屑病治療候選藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料

1. 試劑：苦杏仁苷、咪喹莫特乳膏、地塞米松片、IL-1β、TNF-α、絲聚蛋白、兜甲蛋白、兜甲蛋白、角蛋白10引物、pP38抗體、p38抗體、β-微管蛋白抗體、CD3抗體、杜氏改良 eagle 培養(yǎng)基、胎牛血清、3-2,5-二苯基四氮唑溴化物、二甲基亞砜、重組人IL-17A和TNF-α、醫(yī)用膠帶。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡雄性BALB/c小鼠

3. 細(xì)胞：HaCaT細(xì)胞

儀器

ASCH  VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、光學(xué)顯微鏡、NanoDrop 2000儀器、ViiA7實(shí)時(shí)PCR儀、Bio-rad成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀

實(shí)驗(yàn)過程

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 分組與給藥：

IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型：30只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為對照組、IMQ組、IMQ+DEX組、IMQ+苦杏仁苷低劑量組、IMQ+苦杏仁苷中劑量組、IMQ+苦杏仁苷高劑量組。對照組4只，IMQ組6只，其余組每組5只。連續(xù)灌胃10天，對照組和IMQ組給予水，DEX組給予5mg/kg·d的DEX溶液，苦杏仁苷低、中、高劑量組分別給予15mg/kg/d、30mg/kg/d、60mg/kg/d的苦杏仁苷溶液，灌胃體積均為0.2ml。第4至10天，每天在小鼠背部涂抹50mg 5% IMQ乳膏，連續(xù)7天構(gòu)建銀屑病樣模型。

TS誘導(dǎo)皮膚屏障破壞模型：24只小鼠隨機(jī)分為6組，每組4只，分組同前。連續(xù)灌胃8天，給藥方式與劑量同前。第4至8天，每天在小鼠背部粘貼醫(yī)用膠帶并快速撕下，重復(fù)5次（每天2次，間隔8小時(shí)，連續(xù)5天），直至皮膚發(fā)紅且無明顯出血，構(gòu)建皮膚屏障破壞模型。第11天，頸椎脫臼處死小鼠，收集背部皮膚病變組織。

2. 檢測指標(biāo)：

PASI評分：根據(jù)PASI評分標(biāo)準(zhǔn)，對小鼠背部皮膚的紅斑、脫屑、浸潤增厚進(jìn)行0-4級評分，求和得到總評分，并繪制評分趨勢線。

經(jīng)表皮水分流失（TEWL）：從第4天開始，使用ASCH  VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀檢測小鼠背部皮膚表面的TEWL值，每組小鼠背部取3個(gè)不同部位檢測并取平均值。

ASCH  VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

通過采用TS誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷模型，觀察AMY對小鼠體重、 TEWL 、組織病理學(xué)染色及CD3表達(dá)的影響。與TS組相比，DEX和AMY組的 TEWL 顯著降低，表明AMY能有效防止皮膚水分流失，AMY均能減少皮損處CD3的浸潤。上述數(shù)據(jù)表明，AMY可緩解TS誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷。

組織病理學(xué)與免疫組化：小鼠皮膚組織在4%多聚甲醛中室溫固定24小時(shí)，脫水、包埋后切成4μm切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色和CD3抗體免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡下采集圖像。

實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)：通過Trizol試劑提取皮膚組織總RNA，NanoDrop 2000測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR qPCR Master Mix試劑在ViiA7實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行檢測，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：HaCaT細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。分為4組：對照組、TNF-α+IL-17A組、TNF-α+IL-17A+低劑量苦杏仁苷組、TNF-α+IL-17A+高劑量苦杏仁苷組?？嘈尤受疹A(yù)處理細(xì)胞24小時(shí)后，加入20ng/mL IL-17A和20ng/mL TNF-α刺激8小時(shí)。

2. 細(xì)胞活力檢測：對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞接種到96孔板，每孔5000個(gè)細(xì)胞，設(shè)置對照組和苦杏仁苷組（濃度分別為10、20、40、80、160、320μM），每組4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12小時(shí)后更換含相應(yīng)濃度苦杏仁苷的培養(yǎng)基或?qū)φ战M培養(yǎng)基，孵育24小時(shí)后，加入MTT溶液孵育4小時(shí)，棄去MTT，加入150μL DMSO，振蕩10分鐘后，酶標(biāo)儀檢測570nm處吸光度。

3. 蛋白質(zhì)印跡分析：采用含1%磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒定量蛋白。每樣本30μg蛋白經(jīng)8%丙烯酰胺SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5% BSA室溫封閉1小時(shí)，加入兔抗pp38、p38、β-tubulin一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1小時(shí)，TBST洗滌后，加入顯影劑，Bio-rad成像系統(tǒng)成像，Image Lab軟件分析蛋白表達(dá)量。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0軟件分析。方差齊且符合正態(tài)分布時(shí)采用Bonferroni檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney U法比較。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 苦杏仁苷可緩解IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮炎，改善皮膚紅斑、脫屑、浸潤等癥狀，降低PASI評分，減少經(jīng)表皮水分流失，減輕表皮增厚、角化過度等病理改變，抑制CD3炎癥細(xì)胞浸潤，下調(diào)IL-1β、TNF-α等炎癥因子的mRNA表達(dá)，上調(diào)K10、LOR、IVL等皮膚屏障相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)，且不影響小鼠脾臟指數(shù)，無全身免疫抑制作用。

2. 苦杏仁苷可改善TS誘導(dǎo)的小鼠皮膚屏障損傷，降低TEWL，減少表皮厚度和CD3炎癥細(xì)胞浸潤，下調(diào)IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)，上調(diào)IVL和K10的mRNA表達(dá)。

3. 苦杏仁苷可抑制HaCaT細(xì)胞增殖，在TNF-α和IL-17A刺激的HaCaT細(xì)胞中，下調(diào)IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子的mRNA表達(dá)，上調(diào)FLG、K10、IVL等皮膚屏障相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)，并抑制p38MAPK信號通路的磷酸化。

4. 綜上，苦杏仁苷可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、修復(fù)皮膚屏障功能緩解銀屑病皮損，其作用機(jī)制可能與抑制p38MAPK信號通路磷酸化相關(guān)，為銀屑病治療候選藥物的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。