ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀探究Vdr-KO大鼠的經(jīng)表皮水分流失

2025年1月，來自金澤大學的Satoko Kise研究團隊在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上發(fā)表了題為“Ligand-Independent Vitamin D Receptor Actions Essential for Keratinocyte Homeostasis in the Skin"的研究。該研究旨在闡明維生素D和維生素D受體（VDR）在皮膚中的作用機制，通過對比維生素D受體基因缺陷Vdr-KO大鼠、Vdr-R270L/H301Q突變大鼠（缺乏配體結(jié)合能力）和WT大鼠的皮膚蛋白質(zhì)組成和基因表達模式，探究配體非依賴性VDR作用在皮膚角質(zhì)形成細胞穩(wěn)態(tài)維持中的重要性。

摘要

最近，我們發(fā)現(xiàn)維生素D受體基因缺陷（Vdr-KO）大鼠出現(xiàn)的脫發(fā)癥狀，在具有配體結(jié)合能力缺陷的突變型VDR（R270L/H301Q）大鼠中并未出現(xiàn)，這表明VDR的配體非依賴性作用在維持毛發(fā)周期中起著重要作用。由于Vdr-KO大鼠的皮膚也存在異常，本研究進一步探討了脫發(fā)與皮膚異常之間的關系。為闡明維生素D和VDR在皮膚中的作用機制，我們對比了Vdr-KO、Vdr-R270L/H301Q及野生型（WT）大鼠皮膚的蛋白質(zhì)組成和基因表達模式。結(jié)果顯示，Vdr-R270L/H301Q大鼠的皮膚形成與WT大鼠類似，均表現(xiàn)正常，而Vdr-KO大鼠則出現(xiàn)明顯的角化過度和經(jīng)表皮水分流失現(xiàn)象。RNA測序和蛋白質(zhì)組學分析表明，Vdr-KO大鼠的基因和蛋白質(zhì)表達模式與WT及Vdr-R270L/H301Q大鼠存在明顯差異：Shh、Wnt和Bmp信號通路相關因子的表達降低，毛發(fā)角蛋白表達急劇減少，表皮角蛋白表達則大幅增加。本研究證實，無配體結(jié)合的VDR在毛囊和表皮角質(zhì)形成細胞的分化、增殖及細胞死亡過程中具有重要作用。

關鍵詞：維生素D受體；角質(zhì)形成細胞穩(wěn)態(tài)；配體非依賴性VDR作用；角化過度；脫發(fā)

實驗材料與儀器

實驗材料

1. 實驗動物：Jcl:Wistar大鼠，包括野生型（WT）大鼠、Vdr-KO（維生素D受體基因缺陷）大鼠、Vdr-R270L/H301Q（VDR雙突變）大鼠，均為雄性。

2. 主要試劑：4%多聚甲醛、O.T.C.復合物、抗VDR抗體、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG、蘇木精、伊紅-酒精溶液、脫脂奶粉、Tris緩沖鹽水（TBS）、Tween 20、辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗、ISOGEN II等。

3. 抗體：抗細胞角蛋白14多克隆兔抗體、PCK-26抗體、β-肌動蛋白抗體等。

實驗儀器

冷凍切片機、相差顯微鏡、Minylis個人均質(zhì)器、SDS-PAGE凝膠電泳相關設備、轉(zhuǎn)膜設備、增強化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

實驗過程

1. 動物飼養(yǎng)與分組：所有大鼠均飼養(yǎng)在室溫22-26℃、濕度50-55%、12小時光照/黑暗周期的環(huán)境中，自由進食飲水（飼料為CE-2，Oriental Yeast Co.）。實驗分為WT組、Vdr-KO組和Vdr-R270L/H301Q（KI）組，每組3只大鼠，均為雄性。通過PCR產(chǎn)物電泳確定KO大鼠的基因型，Vdr-KO純合子通過純合子交配維持。

2. 樣本采集：在大鼠4周、7周、11周、15周、22周、30周等不同年齡段，剃除背部毛發(fā)后，剪取背部皮膚組織，部分樣本用于固定冷凍，部分樣本迅速液氮冷凍后研磨成粉末用于RNA提取或蛋白質(zhì)提取。

3. 免疫熒光檢測：皮膚樣本經(jīng)4% PFA固定15小時（4℃），O.T.C.復合物包埋后液氮冷凍，用冷凍切片機制作20μm厚切片。加入抗VDR抗體和Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗進行免疫熒光染色，DAPI染色細胞核后，相差顯微鏡觀察VDR定位。

4. HE染色：皮膚樣本經(jīng)4% PFA固定15小時（4℃），O.T.C.復合物包埋液氮冷凍，制作20-25μm厚冷凍切片。經(jīng)PFA復固定、水洗、蘇木精染色15分鐘、水洗、伊紅-酒精染色2分鐘，再經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，相差顯微鏡觀察皮膚形態(tài)。

5. Western blot分析：剪取的皮膚組織用Minylis個人均質(zhì)器勻漿，提取總蛋白（每泳道上樣20μg），進行4-20%線性梯度SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗孵育，TBS-T洗滌3次，再加入HRP偶聯(lián)二抗孵育，最后通過增強化學發(fā)光免疫檢測法檢測目標蛋白（Krt14、Krt1、Krt5、Krt8、VDR、β-actin等）表達。

6.TEWL檢測：剃除大鼠背部毛發(fā)后，使用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀，基于菲克定律（TEWL = D×dC/dx，D為水蒸氣在空氣中的擴散系數(shù)，dC/dx為傳感器測量的水蒸氣濃度梯度）計算經(jīng)表皮水分流失量，評估皮膚屏障功能。

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

實驗結(jié)論

本研究通過對比WT、Vdr-KO缺乏配體結(jié)合能力的新型KI大鼠，明確證實無配體結(jié)合的VDR（配體非依賴性VDR）在毛囊和表皮角質(zhì)形成細胞的分化、增殖及凋亡過程中發(fā)揮作用。具體結(jié)論如下：

1. 配體非依賴性VDR是維持毛發(fā)周期所必需的Shh、Wnt或Bmp通路相關基因表達的關鍵因素，Vdr-KO大鼠中這些通路基因表達降低，導致脫發(fā)和毛囊異常。

2. 即使缺乏VDR，初始毛發(fā)周期仍可經(jīng)歷生長期和退行期，但從退行期向休止期的轉(zhuǎn)變需要VDR依賴的毛囊上皮鏈凋亡過程，Vdr-KO大鼠中該凋亡過程受阻，形成囊腫并持續(xù)增殖，導致皮膚表面波紋狀改變。

3. Vdr-KO大鼠出現(xiàn)明顯的角化過度、表皮角蛋白表達上調(diào)、毛發(fā)角蛋白表達降低，經(jīng)表皮水分流失增加，皮膚屏障功能受損，且可能存在慢性炎癥，而KI大鼠皮膚表型與WT大鼠一致，表明配體非依賴性VDR對皮膚結(jié)構(gòu)和功能維持至關重要。

4. 促進Shh、Wnt和Bmp信號通路的化合物有望成為治療VDR缺乏相關脫發(fā)和皮膚疾病的潛在藥物。

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