Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀探究大鼠咬肌血流量變化

該研究由北海道健康科學大學牙口腔生物學系的Takeharu Niioka團隊發(fā)表在《Archives of Oral Biology》期刊。研究聚焦大鼠咬肌，圍繞三個問題展開：（1）支配血管的副交感神經是否具有血管活性腸肽（VIP）免疫反應性；（2）靜脈注射VIP是否會誘發(fā)血管舒張；（3）在存在或不存在阿托品的情況下，選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP對副交感神經血管舒張的影響。

摘要

已知副交感神經血管舒張纖維通過膽堿能和非膽堿能兩種機制支配大鼠咬肌的血管，但非膽堿能機制尚不明確。近年來，血管活性腸肽（VIP）已被證實參與口腔頜面部（如下頜下腺和下唇）的副交感神經血管舒張過程，然而關于大鼠咬肌的相關研究卻極為有限。本研究以大鼠咬肌為研究對象，旨在評估：（1）支配血管的副交感神經是否具有VIP免疫反應性；（2）靜脈注射VIP是否會誘發(fā)血管舒張；（3）在存在或不存在阿托品的情況下，選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP對副交感神經血管舒張的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在副交感耳神經節(jié)（OG）以及血管周圍的神經纖維這兩個部位均檢測到VIP免疫反應性。靜脈注射VIP可誘發(fā)血管舒張，而[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP能減弱VIP注射所引發(fā)的血管舒張效應。單獨使用[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP無法抑制副交感神經血管舒張，但當[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP與阿托品聯(lián)合使用時，可減弱副交感神經血管舒張。這些結果表明：（1）支配咬肌血管的節(jié)后副交感神經中存在VIP；（2）靜脈注射VIP可誘發(fā)咬肌血管舒張；（3）當毒蕈堿膽堿能受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿（ACh）釋放受到抑制而失活時，VIP可能參與咬肌的副交感神經血管舒張過程。

實驗材料與儀器

（一）實驗材料

1. 實驗動物：成年雄性Wistar大鼠；

2. 示蹤劑與試劑：2%熒光金、無菌生理鹽水、VIP、選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP、阿托品、烏拉坦、潘庫溴銨；

3. 抗體與染色相關試劑：VIP抗體、囊泡乙酰膽堿轉運體抗體、Alexa-488標記驢抗兔IgG抗體、Alexa-568標記驢抗山羊IgG抗體、熒光素標記蓖麻凝集素I、1%非免疫驢血清、0.3%曲拉通X-100、0.3%牛血清白蛋白、4%多聚甲醛、0.1M磷酸緩沖液、30%蔗糖；

（二）實驗儀器

4. Omegawave FLO-C1 激光多普勒血流儀、熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡、冷凍切片機、Hamilton微量注射器、加熱墊、人工呼吸機、導管（用于股靜脈和股動脈插管）

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

實驗過程

1. 動物飼養(yǎng)與倫理審批

2. 熒光雙標記實驗

3. 免疫組化染色

4. 咬肌血流量測量：實驗前切斷雙側頸迷走神經和頸上交感干，以排除迷走神經和交感神經的影響。通過電刺激左側舌神經中樞切斷端誘發(fā)咬肌副交感神經反射性血管舒張，用Omegawave FLO-C1 激光多普勒血流儀監(jiān)測并記錄咬肌血流量（MBF）變化。分別靜脈注射不同劑量VIP，觀察MBF變化；在注射100ng/kg VIP前20分鐘，持續(xù)輸注[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP，觀察其對VIP誘發(fā)MBF升高的影響。此外，分別在靜脈注射阿托品后、持續(xù)輸注[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP時、以及兩者聯(lián)合使用時，電刺激舌神經，記錄MBF變化，結果以用藥前對照反應的百分比表示。

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

（A） 舌神經（LN）電刺激（對照）及靜脈注射血管活性腸肽（VIP，劑量分別為 1、10 和 100 ng/kg）誘發(fā)平均血流量（MBF） 增加的典型示例。

（B） 匯總了注射 0（僅生理鹽水）、1、10 和 100 ng/kg VIP 后誘發(fā)的 MBF 增加情況（n = 4）。數(shù)據(jù)以LN 電刺激誘發(fā)的對照反應的百分比表示。

（C） （C） 在選擇性 VIP 受體拮抗劑（[4 - 氯 - D - 苯丙氨酸?, 亮氨酸 1?] 血管活性腸肽，[4Cl-D-Phe?, Leu1?] VIP） 存在與缺失時，注射 100 ng/kg VIP 誘發(fā) MBF 增加的典型示例。

（D） （D） [4Cl-D-Phe?, Leu1?] VIP 對 100 ng/kg VIP 注射所誘發(fā) MBF 增加的影響，以預處理反應的百分比表示（n = 5）。

5. 統(tǒng)計分析

實驗結論

1. 支配大鼠咬肌血管的節(jié)后副交感神經中存在VIP免疫反應性，且VIP與VAChT（膽堿能標志物）在耳神經節(jié)的FG標記神經元以及咬肌血管周圍的神經纖維上存在共定位；

2. 靜脈注射VIP以劑量依賴性方式誘發(fā)大鼠咬肌血管舒張，且不影響全身動脈血壓，選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP可抑制VIP誘發(fā)的這種血管舒張效應，表明VIP通過激活咬肌血管壁上的VIP受體發(fā)揮作用；

3. 單獨使用[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP對舌神經刺激誘發(fā)的咬肌副交感神經血管舒張無影響，單獨使用阿托品可部分減弱該血管舒張效應；而當[4Cl-D-Phe?,Leu1?]VIP與阿托品聯(lián)合使用時，可抑制該血管舒張效應，提示當毒蕈堿受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿釋放受到抑制時，VIP參與咬肌的副交感神經血管舒張調節(jié)。

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