糖尿病大鼠牙周炎模型如何用Omegawave FLO-N1激光多普勒血流儀測(cè)量牙齦

Toru Nishikawa團(tuán)隊(duì)發(fā)表于《Journal of the International College of Dentistry》的研究通過(guò)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，在該模型中誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性牙周炎，以一氧化氮（NO）通路為重點(diǎn)，探究糖尿病狀態(tài)下牙周病惡化的機(jī)制，重點(diǎn)分析牙齦血流、炎癥相關(guān)基因（腫瘤壞死因子 -α/TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 /iNOS）表達(dá)及亞硝基應(yīng)激標(biāo)志物（硝基酪氨酸）的變化。

摘要

<目的>為明確糖尿病狀態(tài)下牙周病惡化的機(jī)制，本研究通過(guò)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，在該模型中誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性牙周炎，并以一氧化氮（NO）通路為重點(diǎn)展開(kāi)探討。

<材料與方法>對(duì) 5 周齡雄性SD大鼠，通過(guò)腹腔注射 STZ（60mg/kg）誘導(dǎo)糖尿病。STZ 注射 2 周后，在上頜右側(cè)第二臼齒（M2）的牙頸部結(jié)扎尼龍線（3-0 Surgilon）以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性牙周炎，該側(cè)作為實(shí)驗(yàn)側(cè)；另一側(cè)不進(jìn)行處理，作為對(duì)照側(cè)。實(shí)驗(yàn)性牙周炎誘導(dǎo) 2 周后，先測(cè)量牙齦組織血流，隨后處死大鼠，對(duì)牙齦組織進(jìn)行基因表達(dá)分析及組織學(xué)檢查。

<結(jié)果>糖尿病大鼠對(duì)照側(cè)的牙齦血流顯著低于正常大鼠對(duì)照側(cè)；無(wú)論正常大鼠還是糖尿病大鼠，牙周炎誘導(dǎo)后其牙齦組織血流均較各自對(duì)照側(cè)顯著增加?；虮磉_(dá)分析顯示，正常大鼠中，牙周炎誘導(dǎo)后 TNF-α 基因表達(dá)雖有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而 iNOS 基因表達(dá)顯著增加；糖尿病大鼠中，牙周炎誘導(dǎo)后 TNF-α 與 iNOS 基因表達(dá)均顯著增加。組織學(xué)檢查顯示，正常大鼠牙周炎誘導(dǎo)部位僅見(jiàn)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而糖尿病大鼠該部位可見(jiàn)顯著炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。進(jìn)一步分析牙齦組織中硝基酪氨酸的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，正常大鼠牙周炎誘導(dǎo)部位可見(jiàn)硝基酪氨酸陽(yáng)性細(xì)胞，但糖尿病大鼠在牙周炎誘導(dǎo)后，硝基酪氨酸陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加。

<結(jié)論>本研究證實(shí)，糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織中硝基酪氨酸陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，提示在糖尿病合并牙周病的過(guò)程中，亞硝基應(yīng)激發(fā)揮重要作用；同時(shí)提示，抑制亞硝基應(yīng)激可能成為糖尿病相關(guān)牙周炎的治療策略之一。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：5 周齡雄性SD大鼠

2. 糖尿病誘導(dǎo)劑：鏈脲佐菌素（STZ）；牙周病誘導(dǎo)材料：尼龍縫合線（3-0 Surgilon）；麻醉劑：pentobarbital

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

1. Omegawave FLO-N1激光多普勒血流儀，用于測(cè)量牙齦組織血流

Omegawave FLO-N1激光多普勒血流儀

牙齦組織中的血流值

2. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀：基因表達(dá)定量分析

3. 光學(xué)顯微鏡：用于組織切片染色后的觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù)

4. 低溫儲(chǔ)存設(shè)備：液氮罐（用于組織快速冷凍）、-80℃冰箱（用于組織長(zhǎng)期保存）

5. 加熱墊：用于測(cè)量牙齦血流時(shí)維持大鼠直腸溫度在 37℃

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與糖尿病模型建立

1. 所有 SD 大鼠飼養(yǎng)于恒溫（23±1.0℃）、恒濕（45±10%）的動(dòng)物室，采用 12 小時(shí)明暗交替周期，通過(guò)自動(dòng)供水裝置提供自來(lái)水。

2. 向大鼠腹腔注射 STZ（60mg/kg）以誘導(dǎo)糖尿??；STZ 注射 1 周后檢測(cè)大鼠血糖值，將血糖≥200mg/dL 的大鼠判定為糖尿病模型大鼠，納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（二）實(shí)驗(yàn)性牙周炎誘導(dǎo)

STZ 注射 2 周后，對(duì)所有大鼠（正常大鼠 + 糖尿病大鼠）進(jìn)行處理：（0.5mg/kg，腹腔注射）麻醉下，在上頜右側(cè)第二臼齒（M2）牙頸部纏繞尼龍縫合線（3-0 Surgilon），盡量避免損傷牙齦，于近心口蓋處打結(jié)固定（該側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)）；上頜左側(cè)第二臼齒不做處理（為對(duì)照側(cè)）。

（三）牙齦組織血流測(cè)量

1. 牙周炎誘導(dǎo)后，通過(guò)腹腔注射（0.5mg/kg）麻醉大鼠，將激光多普勒血流儀（FLO-N1）探頭固定于實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè) M2 的頰側(cè)牙齦正上方。

2. 測(cè)量過(guò)程中，將大鼠置于 25℃加熱墊上以維持直腸溫度 37℃，記錄血流值（單位：ml/min/100g tissue）。

（四）組織采集與處理

1. 實(shí)驗(yàn)性牙周炎誘導(dǎo) 2 周后，通過(guò)腹腔注射（1.5mg/kg）處死大鼠。

2. 采集實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè) M2 的頰側(cè)牙齦組織：一部分立即放入液氮快速冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至 - 80℃冰箱保存（用于基因表達(dá)分析）；另一部分連同雙側(cè)上頜組織取下，放入 10% 福爾馬林溶液固定 24 小時(shí)（用于組織學(xué)分析）。

（五）基因表達(dá)分析

1. 用 TRIzol Reagent 從冷凍牙齦組織中提取總 RNA，再以總 RNA 為模板，用 SuperscriptⅢ RNase H-Reverse Transcriptase 合成 cDNA。

2. 采用 TaqMan Universal PCR Master Mix 與 TaqMan 探針，在 ABI Prism 7000 儀器上進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為 95℃ 1 分鐘、52℃ 1 分鐘、72℃ 30 秒，共 40 個(gè)循環(huán)。

3. 以 GAPDH 為內(nèi)參基因，采用 ΔΔCt 法計(jì)算 TNF-α 與 iNOS 基因的相對(duì)表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究證實(shí)，糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織中硝基酪氨酸陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，提示在糖尿病合并牙周病的過(guò)程中，亞硝基應(yīng)激發(fā)揮重要作用；同時(shí)提示，抑制亞硝基應(yīng)激可能成為糖尿病相關(guān)牙周炎的治療策略之一。

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