文獻分享 | IVPT離體皮膚屏障針頭穿刺破壞驗證實驗中經(jīng)皮水分流失值變化靈敏度測試研究

引言

Eman Elmahjoubi團隊與紐卡斯爾大學合作在《Toxicology in Vitro》發(fā)表研究，采用Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀，系統(tǒng)驗證了經(jīng)表皮水分流失（TEWL）法評估體外全層豬皮屏障功能的有效性，為皮膚毒性檢測與屏障功能評估提供了高效替代方案。

摘要 

皮膚屏障功能是開展體外經(jīng)皮吸收研究時需考量的關(guān)鍵參數(shù)。盡管氚水通量測量常被用于評估皮膚完整性，但近幾十年來，更快速、易用的經(jīng)表皮水分流失（TEWL）法已逐漸興起。然而，迄今為止，TEWL與體外皮膚屏障功能之間的相關(guān)性尚未得到全面明確。本研究采用一款基于冷誘導(dǎo)蒸汽阱原理的新型 TEWL儀器，對全層豬皮的屏障功能進行探測。該方法靈敏度足以體現(xiàn)穿刺對屏障功能的影響，不過觀察到的非線性模式提示，可能存在組織腫脹過程和/或毛細作用。多項表面活性劑暴露實驗的結(jié)果充分表明，TEWL 確實在很大程度上可預(yù)測皮膚樣品的完整性。核心研究發(fā)現(xiàn)為：基礎(chǔ) TEWL 與基礎(chǔ)氚水通量呈線性相關(guān)）。因此，專用 TEWL 法可作為氚水通量測量的優(yōu)良替代方案，用于評估全層皮膚屏障功能。

研究背景與目的

1. 皮膚屏障功能評估的重要性：在體外經(jīng)皮吸收研究中，皮膚樣本質(zhì)量控制至關(guān)重要，如 OECD 428 測試指南要求排除受損皮膚樣本。傳統(tǒng)評估方法（如氚水通量測量）存在局限性，包括無法用于氚標記測試化合物、會水合角質(zhì)層、耗時且需放射性物質(zhì)監(jiān)管審批。

2. 替代方法的爭議：近幾十年，經(jīng)皮電阻測量和 TEWL 評估成為氚水通量測量的替代方案。但 TEWL 與體外皮膚屏障功能的相關(guān)性尚未明確，不同研究團隊因皮膚模型、方法和 TEWL 測量儀器的不同，得出的結(jié)果存在沖突。

3. 研究目的：使用新型Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀進一步探究 TEWL 與氚水通量的關(guān)系，驗證 TEWL 方法評估體外全層豬皮膚屏障功能的有效性，具體包括：

? 研究基礎(chǔ) TEWL 速率與基礎(chǔ)氚水通量的關(guān)系；

? 考察穿刺針孔數(shù)量對經(jīng)皮水分流失值的影響，判斷TEWL 方法能否區(qū)分不同穿刺數(shù)量；

? 研究表面活性劑（尤其是陰離子表面活性劑）對皮膚屏障功能的影響，包括表面活性劑鏈長、十二烷基硫酸鈉（SLS）的濃度、體積和接觸時間的作用。

材料與方法

（一）實驗材料

1. 化學試劑：氚水（1mCi/ml）、閃爍液、各類陰離子表面活性劑（SLS、辛基硫酸鈉（SOS）、癸基硫酸鈉（SDS）、十四烷基硫酸鈉（STDS）、二十烷基硫酸鈉（SES））、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH7.4）等，均購自特定供應(yīng)商，實驗全程使用雙蒸去離子水。

2. 皮膚樣本：選用長白豬耳朵，來自當?shù)赝涝讏?，屠宰后立即采集，不進行蒸汽滅菌。清洗后切成約 8cm2 的完整皮膚樣本，無可見缺陷的樣本用鋁箔包裹，在-80℃下儲存不超過 6 個月，使用前室溫解凍并切成適合安裝在擴散池上的小塊。

（二）實驗方法

穿刺皮膚樣本的 TEWL 測量：用 2.5cm 長的 PrecisionGlide 針頭在全層皮膚樣本上穿刺，穿刺位置靠近擴散區(qū)域中心且貫穿組織全層，穿刺數(shù)量分別為 0（對照）、1、2、3、4、5、6、7 個。將穿刺后的皮膚作為屏障膜，接收室含 PBS（pH7.4）的 Franz 池中，皮膚表面保持干燥，插入帶專用供給池耦合器的 Aquaflux 測量探頭，按上述方法測量 TEWL，每個穿刺實驗重復(fù) 4 次，穿刺后 10-15 分鐘開始 TEWL 測量。

研究數(shù)據(jù)

皮膚穿刺次數(shù)對 TEWL 的影響：單個穿刺使皮膚水分流失量比完整皮膚顯著增加約 50%，但 2、3、4 個穿刺孔并未導(dǎo)致 TEWL 進一步顯著變化；當穿刺數(shù)量為 5 個時，TEWL 出現(xiàn)進一步大幅增加，且在 6、7 個穿刺孔時，TEWL 值維持在該升高水平。各穿刺組（除對照）的 TEWL 值相互間無顯著差異，但均與未穿刺皮膚的 TEWL 值有顯著差異。

（Biox Aquaflux經(jīng)皮水分流失測量儀）

結(jié)論

本研究體外穿刺數(shù)據(jù)與其他研究存在差異。Chilcott 等人（2002）用開放室儀器（Evaporimeter）發(fā)現(xiàn)穿刺后 1 小時，TEWL 大小與穿刺孔數(shù)量成正比；Netzlaff 等人（2006）用 Tewameter 發(fā)現(xiàn)僅能區(qū)分完整和單孔穿刺的聚四氟乙烯膜，穿刺孔從 1 增加到 5 時 TEWL 不再升高，且穿刺對人表皮膜 TEWL 讀數(shù)無影響。本研究得到的 “階梯式" 模式介于兩者之間?？赡茉虬ǎ航邮找嚎赡芡ㄟ^孔被吸到皮膚表面形成水膜；穿刺孔可能因皮膚腫脹而閉合；所用針頭尺寸也可能影響實驗結(jié)果。本研究使用具有隔離微環(huán)境的封閉室 TEWL 測量儀器（AquaFlux經(jīng)皮水分流失測量儀）探測體外全層豬皮膚樣本的屏障功能，該方法靈敏度足以檢測到穿刺對皮膚屏障功能的降低作用，但觀察到的非線性模式需進一步研究以明確其機制。

參考文獻：

【1】Aramaki, J., Effendy, I., Happle, R., et al. Which bioengineeringassay is appropriate for irritant patch with sodium lauryl sulphate?Contact Dermatitis 45, 286–290.

【2】Chilcott, R.P., Dalton, C.H., Emmanuel, A.J., et al. Transepidermal water loss does not correlate with skin barrier function in vitro. Journal of Investigative Dermatology 118, 871–875.

【3】Nangia, A., Patil, S., Berner, B., et al. In vitro measurement of transepidermal water loss: a rapid alternative to tritiated water permeation for assessing skin barrier functions. International Journalof Pharmaceutics 170, 33–40.

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